甲基化測(cè)序（5mC）
DNA甲基化（DNA Methylation）是一種重要的表觀遺傳學(xué)修飾，在細(xì)胞分化、增殖、衰老等方面具有重要的調(diào)控作用。5-甲基胞嘧啶（5mC）是最重要的一種DNA甲基化修飾，廣泛存在于植物、動(dòng)物等真核生物基因組中，被稱為“第五堿基”
全基因組甲基化（WGBS）
全基因組甲基化測(cè)序（Whole Genome Bisulfite Sequencing，WGBS）是通過(guò) Bisulfite處理將基因組中未發(fā)生甲基化的C堿基進(jìn)行轉(zhuǎn)換，用以區(qū)分具有甲基化修飾的C堿基，并結(jié)合二代高通量測(cè)序技術(shù)判斷CpG/CHG/CHH位點(diǎn)是否發(fā)生甲基化的一種方法。通過(guò)WGBS，可實(shí)現(xiàn)單堿基分辨率的甲基化位點(diǎn)精準(zhǔn)、高效定位。
PacBio人全基因組甲基化
PacBio長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序可直接對(duì)DNA分子進(jìn)行測(cè)序而不進(jìn)行擴(kuò)增，無(wú)需亞硫酸氫鹽處理或其他特殊的文庫(kù)構(gòu)建方法，即可從單個(gè)文庫(kù)中獲得高度準(zhǔn)確的堿基（熒光）和甲基化（動(dòng)力學(xué)）信息。堿基序列信息和甲基化信息同時(shí)獲取，一份數(shù)據(jù)即可同時(shí)用于SNP、InDel、SV、CNV、甲基化、基因組組裝等研究應(yīng)用，并可識(shí)別單倍型層面等位基因特異性甲基化。
應(yīng)用方向
【醫(yī)學(xué)領(lǐng)域】
- 表觀遺傳學(xué)：研究不同細(xì)胞類型、組織或發(fā)育階段之間的DNA甲基化差異，幫助揭示表觀遺傳變化在生物學(xué)過(guò)程中的作用；
- 個(gè)體差異和種群遺傳學(xué)：研究個(gè)體之間的DNA甲基化差異，有助于解析甲基化的遺傳基礎(chǔ)，以及它如何影響個(gè)體的健康和易感性；
- 疾病發(fā)生機(jī)制：比較正常和疾病狀態(tài)下的DNA甲基化模式，挖掘與疾病發(fā)生和進(jìn)展相關(guān)的甲基化變化，增進(jìn)對(duì)疾病發(fā)生和發(fā)展過(guò)程的理解；
- 環(huán)境影響研究：外部環(huán)境因素（如營(yíng)養(yǎng)、毒素、藥物等）可以影響DNA甲基化，了解環(huán)境因素如何通過(guò)甲基化改變基因表達(dá)，從而影響個(gè)體的生理和疾病風(fēng)險(xiǎn)；
【農(nóng)學(xué)領(lǐng)域】
- 植物生長(zhǎng)調(diào)控：研究不同生長(zhǎng)階段或不同環(huán)境條件下植物組織的甲基化狀態(tài)，揭示DNA甲基化對(duì)基因表達(dá)的影響，進(jìn)而了解其在植物生長(zhǎng)發(fā)育中的作用機(jī)制；
- 環(huán)境適應(yīng)機(jī)制：研究植物在面對(duì)干旱、鹽堿、病蟲害等逆境時(shí)的甲基化模式變化，識(shí)別與抗逆相關(guān)的甲基化標(biāo)記，從而為培育具有更強(qiáng)抗逆性的作物品種提供策略；
- 品質(zhì)形成和改良：分析影響農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)的基因甲基化情況，如糖分、蛋白質(zhì)含量、色澤等，探索如何通過(guò)甲基化修飾來(lái)優(yōu)化作物的營(yíng)養(yǎng)成分和口感；
- 進(jìn)化研究：比較不同物種之間的DNA甲基化模式，揭示甲基化在進(jìn)化中的角色，有助于理解甲基化在物種適應(yīng)和多樣性產(chǎn)生中的貢獻(xiàn)；
案例解析
HiFi測(cè)序發(fā)現(xiàn)WGBS數(shù)據(jù)無(wú)法實(shí)現(xiàn)分型所以無(wú)法解釋hyper-mCpG事件
PacBio HiFi甲基化分析助力罕見(jiàn)病診斷
甲基化可調(diào)節(jié)基因的表達(dá)和關(guān)閉，與癌癥、衰老、老年癡呆等許多疾病密切相關(guān)，是表觀遺傳學(xué)的重要研究?jī)?nèi)容之一。本研究選取152個(gè)家族的276個(gè)罕見(jiàn)病樣本生成HiFi數(shù)據(jù)集，以識(shí)別基因組中罕見(jiàn)的（~0.5%）多個(gè)甲基化CpG富集（hyper-mCpG）的事件。研究比較了WGBS（N = 1184）和HiFi-GS（N = 276）測(cè)得的CpG島數(shù)據(jù)中共有的93個(gè)樣本的相關(guān)性，顯示兩種方法之間有顯著一致性，相關(guān)性為0.90。共識(shí)別出25,543個(gè)罕見(jiàn)的hyper-mCpG，其中81%是等位基因特異性的，并預(yù)計(jì)可能會(huì)導(dǎo)致調(diào)控元件的失活。每位患者平均有30～40個(gè)hyper-mCpG與罕見(jiàn)病基因重疊，基于hyper-mCpG的分析解析了更多罕見(jiàn)病關(guān)鍵基因中先前被忽視的基因中的重復(fù)擴(kuò)增事件，使得更多的罕見(jiàn)病病例得以解釋。研究表明，HiFi測(cè)序可直接檢測(cè)罕見(jiàn)病患者基因組上的串聯(lián)重復(fù)和甲基化，還進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)分型，有助于精準(zhǔn)分析致病原因。
參考文獻(xiàn)：Cheung WA, Johnson AF, Rowell WJ, et al. Direct haplotype-resolved 5-base HiFi sequencing for genome-wide profiling of hypermethylation outliers in a rare disease cohort. Nature Communications, 2023, 14(1): 3090.
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